Doctorado
2008
Universidad Nacional Autónoma de México
El objetivo inicial de este proyecto fue identificar genes cuya expresión en el ovario a las 48 y 96 horas posnatales (momento del crecimiento folicular), fuese diferencial con respecto a su expresión basal en las primeras horas después del nacimiento.
Los ARNs mensajeros (ARNm) extraidos de ovarios de ratones hembra, en las tres etapas posnatales mencionadas anteriormente, se hibridaron contra un microarreglo de alta densidad (8,448 sondas) de ADNc.
El análisis estadístico conformó diferentes grupos con base en el patrón de expresión de los ARNm hibridados. Uno de estos grupos contenía una secuencia con función desconocida (número de identificación dentro del banco de datos del NCBI: DQ067445), cuya expresión aumentó en forma consistente a las 48 y 96 horas posnatales.
El aumento en la expresión de este gen se corroboró por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) semicuantitativa. Tanto el análisis por la PCR, como los resultados obtenidos a partir del Northern Blot, muestran que esta nueva secuencia, cuyo ARNm tiene un tamaño aproximado de 1.8 kb se expresa selectivamente en el ovario.
Mas aún, el análisis por Western blot, utilizando un anticuerpo monoclonal contra el epítope bandera, muestra una banda con un peso molecular aproximado de 52 KDa, lo cual concuerda con el peso molecular estimado para la proteína codificada por Eop-1.
El estudio por hibridación in situ con una sonda marcada con S35 mostró que el ARNm para Eop-1 se expresa tanto en los ovocitos colectados a las 48 horas posnatales, como en los colectados a las 96 posnatales. Sin embargo, la expresión del mensajero que codifica para esta proteína, durante la etapa prenatal, no se había determinado.
Con base en lo anterior, consideramos relevante llevar a cabo el estudio de la expresión del ARNm para Eop-1 en la etapa embrionaria del ovario murino, a fin de ahondar en el conocimiento que se tiene acerca de este nuevo gen.
Se aisló el ARN total de los ovarios colectados en las cuatro etapas previamente descritas. Se procesaron tres grupos respectivamente, con un promedio de 6 ovarios en cada grupo. La concentración del ARN se determinó por análisis espectrofotométrico, mediante lecturas a 260 nm. En todos los casos, se obtuvo una concentración suficiente y se consideraron óptimas las relaciones 260/280 nm, comprendidas entre 1.5 y 2.0 (Tabla 1). Asimismo, la integridad del ARN aislado se corroboró mediante electroforesis en gel de formaldehído y agarosa al 1%. El análisis electroforético mostró para cada muestra, la presencia de dos bandas íntegras, correspondientes a los fragmentos 28S y 18S del ARN ribosomal.
Posteriormente, se llevo a cabo la síntesis del ADN complementario, utilizando como templado 200 ng del ARN total aislado de cada grupo de ovarios. El producto de la transcripción reversa se empleó para amplificar la región codificante del ARNm correspondiente a Eop-1. En la electroforesis de las muestras amplificadas por PCR, se observa una banda cuyo tamaño de 1.5 Kb, corresponde al fragmento completo de la región codificante de dicho mensajero (Figura 1).
Asimismo dicho ADN complementario, se empleó para el análisis de la expresión del ARN mensajero correspondiente a Eop-1, mediante una PCR semicuantitativa en la que se utilizó como control interno, el fragmento ribosomal 18S el cual, se expresa de forma constitutiva en todas las células. Previo a este análisis, se determinó tanto la concentración óptima de oligonucleótidos, como el rango lineal de amplificación requeridos para la amplificación de la región codificante de Eop-1 (Figura 2). Una vez determinadas las condiciones óptimas, se llevó a cabo la PCR semicuantitativa. Debido a que las temperaturas de alineamiento específcas tanto para Eop-1, como para el fragmento ribosomal 18s, eran diferentes, se realizaron las reacciones de amplificación respectivas, por separado. Las electroforesis de ambas reacciones se muestran en la figura 3; se observa que existe un aumento en la expresión del ARN mensajero de Eop-1 a los 18 días poscoito, comparado con la expresión constitutiva del control interno.
De igual forma y con el fin de generar una sonda específica para Eop-1, se amplificó por medio de la PCR, un fragmento de 347 pares de bases (Figura 4), el cual se clonó dentro del vector pGEM-T. Células bacterianas se transformaron con el producto de ligación y posterior a la purificación, el plásmido transformante se digirió con la enzimas NcoI y Not I. El resultado de la digestión de dos plásmidos, se muestra en la Figura 5, en la cual se observan bandas con dos tamaños distintos, una banda corresponde al vector de ligación (3 Kb) y la otra corresponde a Eop-1. Asimismo, la dirección en la que se incorporó el inserto dentro de uno de los plásmidos, se determinó mediante secuenciación automática, la cual demostró, que dicho inserto se clonó en dirección 3' → 5'. Posteriormente, se llevó a cabo la linearización del mismo y se determinó la concentración de ADN mediante electroforesis, utilizando una escalera de masa como referencia. Una vez linearizado el plásmido con las enzimas convenientes, se procedió a la transcripción in vitro de la ribosonda para la hibridación in toto. La integridad de dicha ribosonda, se corroboró por electroforesis en gel de agarosa al 2%. En la figura 6 se observa la migración electroforética de dos bandas, las cuales corresponden a las sondas sentido y antisentido, con un tamaño de 347 pares de bases.
El estudio por hibridaciónin in toto mostró que EOP-1 se expresa específicamente en el ovario a las 96 horas posnatales. Mas aún, el experimento realizado nos indicó que la estandarización de la técnica fue adecuada y por tanto se procederá a la hibridación, en tejido colectado a los 18 días poscoito, momento que de acuerdo a lo observado en los experimentos por PCR, se presenta una expresión suficiente del mensajero para Eop-1, para lograr una detección del mismo.
