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Modelo in vivo para el análisis funcional del promotor Catsper1 en testículo murino

Antecedentes: Los canales de calcio tienen un papel importante en los procesos de maduración, movimiento flagelar y la capacidad de fertilización del espermatozoide. El canal Catsper (cation channel sperm) se expresa exclusivamente en testículo, específicamente en el flagelo de los espermatozoides. La actividad de este canal esta estrechamente relacionada con la hiperactivación flagelar del espermatozoide, que junto con la reacción acrosomal, le permite al espermatozoide la penetración de la zona pelúcida del óvulo para la fertilización. Los ratones nulos en el gen Catsper1 producen espermatozoides que carecen de hiperactivación y en consecuencia se ha observado su infertilidad en ensayos de fecundación in vitro. Asimismo, en hombres con astenozoospermia, se observó la baja expresión del gen CATSPER1. Entonces, la expresión del gen Catsper1 tiene un papel principal en la hiperactivación del movimiento flagelar, proceso esencial para llevar a cabo la fertilización del óvulo. En nuestro laboratorio se ha realizado la clonación del promotor murino y de humano de Catsper1 y se ha caracterizado su actividad transcripcional in vitro mediante transfecciones transitorias en líneas celulares. Se ha observado que los factores Sox 5 y Sox 9 tienen un efecto positivo sobre el promotor Catsper1, y que ambos actúan de manera sinérgica. Este efecto positivo se revierte al mutagenizar el sitio Sox B en el promotor Catsper1. Estos resultados se obtuvieron en un sistema celular heterólogo in vitro, debido a que no se tiene una línea celular espermatogénica en estado meiótico y postmeiótico. Desconocemos si realmente el promotor de Catsper1 es regulado por estos factores de transcripción en el ambiente testicular. También se desconoce el efecto del silenciamiento de estos factores transcripcionales sobre la expresión de Catsper1 durante la espermatogenésis. Por lo que en el presente proyecto planeamos realizar experimentos in vivo para analizar la actividad transcripcional del promotor CatSper1 dentro del ambiente testicular durante la espermatogénesis y analizar el efecto de inhibidores de los factores transcripcionales que lo regulan. Objetivo: Evaluar en un modelo in vivo la actividad transcripcional del promotor Catsper1 por la expresión de genes reporteros y analizar el efecto del silenciamiento e inhibición de los factores transcripcionales Sox en la expresión de los genes Catsper de testículo murino. Material y métodos: El promotor Catsper1 se encuentra clonado en un vector que contiene al gen reportero de luciferasa, el cual ha sido acortado en su extremo 5´ de forma secuencial para obtener una serie de construcciones y esta mutado en tres sitios de reconocimiento para Sox. A partir de estas construcciones se subclonará el promotor Catsper1 a un vector pIRES que contiene el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) para monitorear la expresión in vivo durante la espermatogénesis. Todos los plásmidos serán evaluados en su expresión en un modelo de testículo murino mediante la transfección in vivo con la inyección del ADN recombinante con un agente de transfección celular. Se detectará la actividad transcripcional del promotor inoculado en testículo mediante el análisis de preparaciones de crio-cortes histológicos de testículo de ratón. Los cortes se analizarán por microscopía de epifluorescencia para la localización de las células en las cuales el promotor Catsper1 expresa la GFP. Por otra parte, también serán transfectadas contrucciones del promotor Catsper1 con el gen luc de luciferasa en testículo para cuantificar la actividad transcripcional mediante el ensayo de quimioluminiscencia. La expresión de los genes Sox5 y Sox9 será evaluada en células espermatogénicas y ambos serán inmunolocalizados en cortes de testículo para correlacionar su presencia durante la expresión de Catsper1. Las mutaciones en los tres sitios Sox del promotor serán evaluadas con el fin de determinar su efecto en la actividad transcripcional in vivo. Los factores Sox requieren localizarse en el núcleo de las células espermatogénicas para regular la expresión de genes por lo que la importación a núcleo será inhibida para evaluar su efecto en la transcripción de Catsper1. Ambos factores transcripcionales Sox9 y Sox5 que se expresan en testículo serán silenciados por medio de la transfección de plásmidos portadores de shARN de interferencia para evaluar el efecto del silenciamiento de estos factores en la expresión del gen Catsper1.

RELACIÓN DEL FACTOR TRANSCRIPCIONAL SRY HUMANO CON LA EXPRESIÓN DE GENES MODULADORES DE LA PRESIÓN ARTERIAL

Antecedentes. El factor transcripcional “sex determining region Y” (SRY) es ampliamente conocido por su papel importante en la diferenciación gonadal masculina. El gen SRY se encuentra localizado en el cromosoma sexual masculino de mamíferos, cromosoma Y en humanos, y su expresión temporal ha sido estudiada durante la embriogenésis. En otras funciones se ha encontrado estudios recientes que muestran que SRY regula genes relacionados con la hipertensión como lo son los genes del sistema Renina-Angiotensina y el gen Th de la Tirosina hidroxilasa, enzima limitante en la biosíntesis de catecolaminas. Sin embargo, existe una mayor predisposición al desarrollo de hipertensión en la población masculina, que podría atribuirse a la expresión de factores exclusivamente masculinos. En ratas hipertensas se ha observado que la expresión de un locus de este gen SRY funge como regulador maestro de los genes que se encargan de la homeostasis de la presión arterial en el sistema Renina-Angiotensina. Asimismo, se ha demostrado in vitro que el factor transcripcional SRY también actúa como como regulador de los promotores de los genes del sistema Renina-Angiotensina (SRA) de humano. Hasta ahora se desconoce si este factor se co-expresa con los genes del sistema renina-angiotensina en diferentes tejidos en edad adulta. Tampoco se tiene evidencia que exista una correlación entre los niveles séricos de SRY y las fluctuaciones en los niveles de las proteínas del SRA en la población masculina. Por lo que es necesario realizar el estudio piloto en el que se establezcan las bases para determinar si el factor transcripcional SRY regula la expresión de los genes moduladores de la presión arterial en una población masculina humana. Objetivo: Determinar la relación/asociación del factor transcripcional SRY humano como regulador de los niveles de las proteínas/péptidos Tirosina hidroxilasa, Angiotensina, Renina, ACE1 y ACE2 del Sistema Renina-Angiotensina que modulan la tensión arterial en la población masculina Material y Métodos: Se realizará un análisis de la región promotora de los genes del sistema Renina-Angiotensina utilizando el programa Haploview para reconocer las variantes que se presentan en los sitios de unión a SRY entre diferentes poblaciones. Los promotores de genes del SRA y Th serán clonados en un vector con el gen reportero de luciferasa para evaluar su actividad transcripcional en una línea celular de origen humano. Los polimorfismos localizados en sitios de unión a SRY de los promotores de genes del SRA y Th serán analizados por mutagenesis dirigida en las construcciones portadoras de los promotores y se evaluarán en un sistema in vitro. Por otra parte se determinara la expresión de los ARN mensajeros de SRY, Th y genes del SRA, asímismo se detectarán las proteínas SRY, Th y del SRA en un panel de tejidos para relacionar su co-expresión en tejidos específicos. Se evaluarán los niveles de SRY, Th y proteínas del SRA en suero de la población masculina mediante ensayos tipo ELISA, con el fin de establecer los niveles para los grupos de individuos normotensos e hipertensos.

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DEL ARN LARGO NO CODIFICANTE (Catsper1au) EN LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE LA ESPERMATOGÉNESIS.

Antecedentes Las células germinales masculinas producen ARN mensajeros únicos los cuales no tienen similitud con ningún otro transcrito de células somáticas, como los genes del canal CATSPER. CATSPER es un canal catiónico conformado de 4 proteínas principales y otra accesorias, fue detectado exclusivamente en la región principal del flagelo de espermatozoides. Este canal es necesario para la hiperactivación de la motilidad y la fertilidad ya que se requiere para penetrar la zona pelúcida que rodea el ovocito. La disrupción de los genes de la familia Catsper resulta en un canal no funcional que conduce a una hiperactivación deficiente y a la infertilidad masculina. Esto lo convierte en un blanco ideal para el desarrollo de un anticonceptivo no hormonal para bloquear el canal sin producir efectos secundarios. Sin embargo, no ha sido posible reconstituir este canal en un sistema in vitro de expresión heterólogo lo que dificulta el estudio de fármacos antagonistas que pudieran bloquearlo. Debido a la importancia del canal CATSPER en la biología de la reproducción nuestro grupo trabaja con el promotor del gen Catsper1 tanto de ratón como de humano para conocer sus mecanismos de regulación. Así, se encontró que los factores SRY y CREB regulan el promotor de CATSPER1 humano y Sox5 y Sox9 al de Catsper1 murino. Asimismo, se observó que el promotor del gen Catsper1 murino es bidireccional in vitro en células espermatogénicas expresando en sentido a Catsper1 y en antisentido a un nuevo gen. Este nuevo gen nombrado Catsper1au [gen río arriba y en antisentido a Catsper1, número de acceso en NCBI: KX825862]. Al igual que Catsper1 se expresa en gonadas masculinas, exclusivamente en el núcleo de células espermatogénicas y de Sertoli. Lo anterior y el hecho de que no es traducido in vitro indican que Catsper1au es un ARN largo no codificante (ARNlnc). Los ARNlnc derivados de promotores bidireccionales pueden regular positiva o negativamente la expresión de su gen vecino que codifica para una proteína. Esto hace factible que el ARNlnc Catsper1au regule la expresión de Catsper1 y que afecte la hiperactivación del espermatozoide y su capacidad de fertilización. Así, en este trabajo se plantea determinar si Catsper1au regula positivamente la expresión de Catsper1 y/o de otros genes involucrados en la espermatogénesis y si esto repercute en la hiperactivación del espermatozoide y la fertilidad. Objetivo Determinar el papel del lncRNA CatSper1au en la expresión del gen divergente Catsper1 murino y su función en la espermatogénesis y en la fertilidad. Material y métodos Con este fin se procedera a silenciar la expression del gen ARNlnc CatSper1au mediante la utilización de oligos antisentido protegidos transfectados en la línea celular espermatogénica GC1spg. Se analizará por PCR de tiempo real la disminución en el transcripto de CatSper1au. Una vez verificado el silenciamiento se obtendrán las muestras para ARNseq y se analizará el cambio en los niveles de expresion génica de los genes Catsper y/o de otros genes. Se identificarán las proteínas que podrían interactuar con el ARNlnc Catsper1au para regular a Catsper1 u otros genes mediante Northwestern blot y “Pulldown” por afinidad de ARN. Las proteínas que interaccionan con el ARNlnc Catsper1au seran identificadas por espectrometría de masas. El papel de Catsper1au en la hiperactivación de los espermatozoides y la fertilidad se analizará en ratones transfectados con los oligos para silenciar CatSper1au. De los cuales se verificará el por seguimiento de los genes desregulados con PCR de tiempo real. Los ratones silenciados en Catsper1au seran analizados en la hipertactivación de sus espermatozoides y serán cruzados con hembras para analizar la afectación en su capacidad reproductiva. Se espera que los ratones silenciados en CatSper1au sean infértiles debido a una possible disminución en la hiperactivación de los espermatozoides. El estudio abrirá nuevos horizontes en el área de la fertilidad y permitirá proponer estrategias para silenciar a Catsper1au y así abatir la expresión de Catsper1, como un posible método anticonceptivo masculino.

Papel de CrebA y Cremτ en la regulación del promotor del gen Catsper3 murino.

Antecedentes: El gen Catsper3 codifica para una de las cuatro subunidades α que componen al canal de calcio CatSper (Canal catiónico de los espermatozoides), ubicado en la pieza principal del flagelo de los espermatozoides. La proteína Catsper3 es esencial para la correcta función del canal CatSper, la hiperactivación de los espermatozoides, la penetración de la zona pelúcida del ovocito y en consecuencia para su fecundación. A pesar de que se ha caracterizado su funcionabilidad y relevancia para la fertilidad masculina, nada se conoce sobre su regulación a nivel transcripcional. En ratones knockout para el gen Crem se ha observado que existe una desregulación de la expresión del mRNA de genes post-meióticos, incluyendo algunos genes Catsper, que genera el fenotipo de infertilidad. Además, nuestro grupo de investigación ha demostrado que la expresión de CATSPER1 humano es regulada por CREBA y CREMτ, mientras que la expresión de Catsper2 murino es regulada por Cremτ. Objetivo: Realizar la caracterización de su región promotora, determinando el papel de los factores transcripcionales CrebA y Cremτ en la regulación del promotor del gen Catsper3 murino. Material y métodos: Para cumplir el objetivo planteado se realizarán deleciones estratégicas del promotor apoyándose en los resultados de la predicción de elementos de promotor basal y de sitios de unión a factores de transcripción. Estas construcciones serán transfectadas en las líneas celulares GC-1spg y MSC1 y mediante ensayos de luciferasa se delimitará el promotor basal. En seguida, se realizará la clonación de los factores de transcripción CrebA y Cremτ en el vector de expresión pcDNA6 que se co-transfectaran con las construcciones seleccionadas del promotor para analizar su efecto. A continuación, se realizarán mutaciones de elementos de promotor basal y sitios CRE predichos, seguido de ensayos de luciferasa para evaluar su papel sobre la actividad del promotor. Finalmente se tratará de demostrar la unión de CrebA y Cremτ al promotor de Catsper3 murino in vivo mediante ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de tejido testicular y hepático, así como identificar con precisión la secuencia de reconocimiento para CrebA y Cremτ dentro del promotor mediante ensayos de cambio en la movilidad electroforética (EMSA).

  • Postdoctorado 2004
    Instituto de Investigaciones, Biomédicas,UNAM

  • Doctorado 1999
    CINVESTAV,IPN

  • Maestría 1996
    UNAM

  • Licenciatura 1992
    UNAM

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